实验所需仪器：离心机，移液器。

　　 一、实验目的：

　　了解动物细胞染色体制片的原理，学习骨髓细胞染色体的制片方法，观察动物细胞染色体的数目和形态。

　　二、实验原理：

　　染色体是基因的载体。真核细胞染色体的数目和结构是重要的遗传指标之一。制备染色体标本是细胞遗传学最基本的技术，优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。

　　染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。

　　小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织。利用骨髓的制片技术虽然需要离心以及细致的操作，但其基本程序是简便的。另外，在骨髓细胞中，有丝分裂指数相当高，因此可以直接得到中期细胞而不必象淋巴细胞或其它组织那样要经过体外培养。主要的中期相来自成红细胞系统，也来自各种骨髓母细胞，单核细胞和淋巴细胞的分裂相是较少的。不过，在染色体制片上已无法区别上述来源。多倍体的中期相（4n、8n和16n）往往来自于巨核细胞。

　　对大型动物通常采用对骼骨、脊或胸骨穿刺术吸取红骨髓，小型动物多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。通过骨髓得到的染色体是比较简便的，一般也无需无菌操作。在临床上多用于白血病的研究。在实验条件下，这种染色体是机体内真实情况的反映，因此在药品检验、环境监测、食品检验等工作以及致畸、致癌、致突变等研究中，利用骨髓制片的方法易于观察毒性物质在体内对细胞和染色体的影响。

　　不过，在有些情况下，穿刺取骨髓较困难，或者希望对同一个体材料进行连续的对比取材，以观察药物或环境因素对人类或动物的影响及染色体的动态变化。这时，采用外周血细胞而不伤害供血者直接制备染色体的技术就十分有利了。

　　三、实验步骤：

　　1．前处理：两栖类是变温动物，因此气温低时，代谢慢，分裂相较少。所以一般在气温较高的季节做。如果气温较低时操作，可于实验前25℃预培养一周时间以提高蟾蜍的细胞活动性，增多分裂细胞相。取骨髓细胞前5－8小时向蟾蜍腹腔内注射秋水仙碱溶液。（每10克体重注入10-30μg秋水仙碱）

　　2. 双毁髓法处死蟾蜍，剖出股骨，将股骨上的肌肉用1％柠檬酸钠溶液洗净；

　　3．剪去股骨两端，用注射器吸取生理盐水溶液1ml，将针头插入骨髓腔，以有1％柠檬酸钠溶液将骨髓细胞冲入离心管中(注意预温药液至25℃)，反复吹洗直至骨腔变白；

　　4．用吸管反复吹打骨髓细胞悬液几次，即得单细胞悬液；

　　5．将所得的骨髓细胞悬液1000rpm离心10分钟，吸去上清液，加预温至25℃的0.075mol/L KCl 5～8ml，立即用吸管吹打均匀，25℃条件下静置低渗20分钟。

　　6．往低渗处理后的细胞悬液中加入2-3滴甲醇－冰醋酸固定液，吹打均匀进行预固定；

　　7．1000rpm离心10分钟，去上清，沿管壁加 5～8ml甲醇-冰醋酸（3∶1）固定液，立即吹散打匀，静置15分钟后用吸管再吹打一次，打散细胞团块。再静置15min

　　8. 1000rpm离心10分钟，去上清，留约0.1～0.2ml的沉淀细胞和上清液，视细胞多少可再加甲醇-冰醋酸（1∶1）固定液2～3滴，用吸管反复轻吸混匀，制成细胞悬液。

　　9．取冰箱中预冷的洁净载玻片，30°倾斜，用吸管吸取一滴上述细胞悬液，于载玻片上适当高度滴在载玻片上，立即吹散吹匀细胞，扩散平铺于玻片上，空气中自然干燥。

　　10．载玻片充分干燥后，用pH6.8的磷酸缓冲液按1份Giemsa原液9份磷酸缓冲液混匀后染色。材料面向上，用染液覆盖载玻片，染色10～15分钟，用流水洗去多余染液，再用吸水纸吸干多余水分，干燥后即可镜检。

　　注：

　　1. 在高倍显微镜下观察蟾蜍骨髓淋巴细胞的染色体。我们可能看到有11对(2n=2×11＝22)等臂的染色单体，每一条都呈V字形。牛蛙的体细胞染色体数目2n=26,其中有5对大型染色体和8对小型染色体。

　　2.第3步可省去，改用1ml 注射器直接钻入骨末端即可，避免剪去骨骺时损失过多骨髓细胞；

　　3.在分离股骨大转子一端时，应防止折断股骨头；

　　4.如有需要，细胞悬液可用尼龙网过滤，进一步去除骨碎片及杂质。

　　四、实验结果及思考题

　　1．在低倍及中倍镜下观察Giemsa染色之后的染色体制片，寻找适当的中期相。

　　制片应为全部染色体较集中，而各个染色体分散、互不重叠、长短收缩适中、两条单体分开、清楚地显示出着丝点位置、染色体呈红紫色。

　　2．找出分散适度的中期染色体图象，在油镜下进行仔细观察，熟悉蟾蜍染色体的形态，统计2n的染色体数目。

　　3．KCl溶液低渗处理与滴片过程在染色体制片中有何联系，对制片结果各有何影响？

　　4．骨髓细胞染色体标本制作时，为什么要采用冰片滴片？

　　5．在本实验中造成染色体标本制做不佳的原因有哪些？

　　1) 秋水仙素用量太多或处理时间过长，会导致染色体的过分凝缩或着丝点裂解，最终会引起染色体形态不正常，甚至被破坏或溶解。

　　2) 低渗处理不好。低渗液的量、处理时间均与细胞的数量有关。低渗过度，细胞会破裂；低渗不足则染色体在一起，分散不开。

　　3) 离心速度或离心时间的影响。离心速度过大或离心时间过长，则会引起细胞破裂；反之，离心速度过小或离心时间过短，则细胞沉降不下来，则会引起大量细胞的丢失。

　　4) 固定液要随用随配，固定彻底后再打散细胞团块，否则细胞容易破碎，染色体分散亦受到影响。

　　5) 载玻片有油脂或冷却不够，则会影响染色体的附着和铺展。

　　6) 用吸管吹散细胞时用力必须尽量轻柔，用力过大则会造成细胞破裂，而染色体也会弥散在溶液中，在随后的离心中将会丢失。

　　7) 滴片时的高度很重要，高度过低细胞不会破裂；过高则染色体过于分散甚至丢失，无法辨别出染色体的准确数量。

　　6． 从一般意义上讲，染色体标本制做的四大要点是什么？

　　答：A、植物血球凝集素（PHA）处理获得活跃分裂的细胞；

　　B、秋水仙素处理可使细胞分裂(cell division)停止在中期；

　　C、低渗处理可使染色体分散；

　　D、空气干燥法可使染色体平铺在载玻片上。