测序酶是一种经过修饰的T7噬菌体DNA聚合酶,用于催化自动或人工双脱氧等温DNA测序反应.同经典测序反应用酶一样,如大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段,测序酶缺乏3’-5’外切酶活性.然而与细菌酶相比,测序酶能够产生非常漂亮的DNA梯带,每条带都具有相似的强度和可读的DNA序列可覆盖凝胶的全长.测序酶自从被次啊用以来,他几乎完全取代了Klenow片段.其优点是无论次啊用小规模还是大规模、手工还是自动的操作均能取得满意的记过.

　　有几种版本的测序酶可以使用,但大部分DNA测序反应都采用的是2.0版,该测序反应包括以下三个步骤.

　　双链DNA模板变性：（如果需要）以及引物和互补序列退火

　　短时的聚合反应：使引物延伸20-100个核苷酸.这一步要在聚合酶过量且4种dNTP浓度有限的条件下进行.这一反应中,应有一种放射性标记dNTP的,从而使这一段的延伸物能在多个位点掺入放射性标记物.在这个初步聚合反应中,绝大多数可用的dNTP,包括放射性标记的dNTP都应掺入到DNA中.

　　已延伸放射性标记引物的延伸和终止反应：该步骤包括四种反应,需高浓度未标记的dNTP和单一的未标记的ddNTP（ddA、ddG、ddC或ddT）.

　　无论使用单链模板还是变性双链DNA模板,2.0版测序酶均能产生非常好的DNA测序结果.本方案参照了Tabor和Richardson的方法,采用单链DNA模板进行DNA测序.与用测序酶进行测序反应相关的变性双链DNA模板的指标方法在第12章方案2已有描述.用PCR扩增DNA进行测序的资料,请见有关信息栏.

　　每一套测序反应需要1ug单链DNA或2.0ug变性双链质粒DNA.双链线形DNA需要变性,并使它与引物复性.即先把天然模板DNA与过量引物混合,在沸水浴中加热约2min,然后把试管插入冰水浴中,不要让混合液温度回升,立即使用.

　　小规模制备M13噬菌体重组子单链DNA的浓度一般在0.05-0.5ug/ml的范围中.这取决于特定噬菌体的生长速度.在正常测序反应条件下,模板DNA是过量的,因而每次测序反应中模板量上的微小变化并不影响测序结果的质量.

　　放射性化合物：

　　[α-35S]d ATP(1000Ci/mmol,10mCi/ml)或

　　[α-33P]d ATP(1000-3000Ci/mmol,约20mCi/ml)或

　　[α-32P]d ATP(1000Ci/mmol,10mCi/ml)

　　若不用放射性标记的[32P] d ATP作为内标记,也可以用5’端以32P标记的寡核苷酸引物进行测序反应.此时可用放射性标记引物（约5*105cpm；约0.5ng）和2ul水代替反应中的未标记引物（步骤1）和放射性标记d ATP（步骤7）,其他步骤相同.一般用多核苷酸激酶催化ATP的[γ-32P]转移至寡核苷酸5’末端.

　　离心机和转头：

　　离心转头或用于0.5ml微量离心管的衔接头,以及甩平式转头的微量滴定板架（如Sorvall公司产品）,聚苯乙醇泡沫或橡胶衬垫.

　　专用设备：

　　微量离心管（0.5ml）或微量滴定板（柔韧,耐热,每孔容量约为300ul的U型底96孔板）.

　　可加热到37℃和65℃的水浴和加热板.

　　方法：

　　重要：当测序的双链质粒DNA已经变性,并已于引物退火（方案2）,可以忽略本方案的前两部,直接从步骤3开始.

　　1、  从0.5ml微量离心管或微量滴定板孔中加入：

　　    单链模板DNA   (1ug/ul)                     1ul

　　    寡核苷酸引物（约1ng/ul）                    3ul

　　    5*测序酶反应缓冲液                          2ul

　　    含MgCl2或MnCl2    

　　    水                                     至终体积为10ul

　　2、封闭试管,在65℃孵育2min,然后取出离心管,使之在3-5min内冷却至室温.

　　有些实验人员喜欢用小加热板或装水的烧饼,使该退火反应在30min的过程中缓慢冷却.我们实验发现,这两种方法的实验结果相同.

　　3、在引物和模板降温时,融合5*标记混合液,ddNTP延伸/终止混合液和放射性标记的dATP,溶化后置于冰上.

　　或有必要,退火的模板和引物可在-20℃下保藏几个月.

　　4、取2.5ul每种ddNTP延伸/终止混合液加至用彩色标记或用字母C、T、A、G标记的各种0.5ml微量离心管或微量滴定板各孔中.当液滴挂在离心管壁或微量滴定孔板璧是,应离心使之沉入底部.

　　5、将5×标记混合液用冰预冷的水稀释5倍,每种测序反应需要2ul稀释的标记混合液.

　　6、用冰预冷的测序酶稀释液稀释测序酶,如材料中所述可加,也可不加酵母焦磷酸酶.

　　    每种模板测序需要2ul测序酶（含3单位）.测序酶要始终放置在冰上.

　　7、为进行标记反应,在步骤2的10ul退火反应液中加入如下溶液;

　　    稀释的标记混合液（来自步骤5）              2ul

　　    0.1mol/L二硫苏糖醇                         1ul

　　    [α-35S]d ATP,[α-33P]d ATP或 [α-32P]d ATP  0.5ul

　　    稀释的测序酶（约1.6u/ul）                  2.0ul

　　    轻轻拍打离心管壁或滴定板以便混匀反应物,然后在20℃孵育2-5min.

　　    稀释的测序酶应保存在冰上,不要使其温度升至室温.供应商提供的浓缩酶应贮存在-20℃,如果置于冰上几小时酶将失活.

　　8、在标记反应将近完成时,应于37℃预热离心管或微量滴定板以便进行种植反应.这一步很重要.然后,转移3.5ul标记反应液到已经预热的、做好标记的、已加入适量的双脱氧混合液（上述步骤4）的微量离心管壁或微量滴定板孔壁上.

　　9、在室温下,将微量离心管放入微量离心机中（用适合于0.5ml离心管的转头或衔接头,或将其置于去盖的1.5ml离心管中）,或将微量滴定板置于有适合线接头的离心机中,以2000r/min离心C、T、A、G管或板几秒钟,混匀混合液.然后立即将反应物置于37℃加热板或水浴中3-5min.

　　10、加4ul甲酰胺上样缓冲液终止反应.

　　11、这些反应物在-20℃时最多保存5天,也可以用变性凝胶电泳直接分析.热变性后（100℃,2min）,在冰上快速冷却.取C、T、A和G反应物各3ul加入测序凝胶的各孔中.