犬寄生虫病很常见，寄生于整个消化道，但没有观察到病理变化。本实验目的是分离利什曼病感染狗的固有层细胞，以进一步探讨肠道寄生虫与内脏感染的发病是否密切相关。获得狗活检组织与胶原酶II孵育。在细胞悬液中，加入表面和细胞表型和胞内标记物的抗体。对利什曼病中固有层细胞的研究报道较少。通过这个组织的标记物确定特别是在利什曼原虫在肠道细胞内感染不会引起病变。

　　主要试剂：

　　磷酸盐缓冲液（PBS – NaCl; KH2PO4; Na2HPO4和蒸馏水）

　　HBSS

　　不完全和完全介质（小牛血清） Roswell Park Memorial Institute （RPMI）

　　肝素钠钠盐，最低99.5％滴定度，SIGMA-ALDRICH?

　　Ⅱ型胶原酶（Sigma＃S-7900）

　　BSA（牛血清白蛋白）

　　Azida 2mM

　　主要设备：

　　剪刀

　　钳子

　　培养皿

　　1.5，2.0，15和50mL试管

　　热孵化器（振荡器）

　　细胞培养离心机（Thermo Scientific multifuge X3R）

　　巴斯德吸管

　　实验步骤：

　　1．除去结肠穿孔活检分离固有层细胞，在无菌培养皿中用不完全介质（RPMI）彻底清洗整个结肠清除粪便，将结肠片段转移到另一个含有10mL完整的介质的培养皿中，置于冰上。

　　2．用小镊子，手术剪除去结肠片段中的脂肪是细胞高效分离的关键步骤。

　　3．将样品放在无菌培养皿中缓慢搅拌10分钟，用巴斯德吸管取出上清液并弃掉，这个过程重复六次。

　　4．将组织碎片转移到含10mL培养液（DTT）的培养瓶中，37℃，震荡30分钟（120RPM），弃掉培养液，这一步持续30分钟。

　　5．加入10mL洗涤液，37℃（(HBSS/HEPES）震荡10分钟（120RPM），洗去组织碎片中的DTT。

　　6．关键的一步：从结肠组织中的除去胶原蛋白这个过程是必不可少的。

　　7．这一步后，组织碎片中加入10ml胶原酶溶液，37℃摇轻轻振动筛（120RPM）45分钟。

　　8．45分钟后吸取出胶原酶溶液上清，转移到 Falcon? 15mL试管中。在4℃离心上清10分钟（1400RPM），加入0.5μL完全介质重悬浮，置于冰上。所有这些步骤必须重复四次。

　　9．细胞放在一个 Falcon? 15mL试管中，加入9ml蒸馏水溶解红细胞，10秒后加入1mlPBS中和这一步。之后4℃离心10分钟后（1400RPM），用0.5μL完全培养基重悬浮颗粒。

　　10．使用 Neubauer相机分析10μL样本中细胞数量，细胞数量应校准到1×107细胞/ ml。细胞可以阻断阴性利什曼犬血清，置于冰上至少20分钟。

　　11．利用台盼蓝染料（0.4% (wt/vol) in HBSS）鉴别细胞活力。这个反应是基于事实，除非膜损坏台盼蓝不与细胞相互作用。

　　12．稀释抗体浅标记ADS，胞内标记物在透化性缓冲溶液内。

　　13．将浓度1×107个细胞/ mL细胞悬液（20μL）放于96孔U型底板在细胞表面加入抗体。

　　14．将96孔板冷藏15分钟，之后每孔加入150μL预冷的 PBS， 4oC（1300RPM）离心10分钟，弃掉上清。加入2％的甲醛200μL固定细胞。

　　15．将细胞加入到流式细胞仪管（荧光激活细胞），避光储存在冰箱中。

　　16．移去上清液胞内标记物，加入150μL PBS-w， 4oC1300RPM离心样品10分钟，再次移出上清液。新增的透化性缓冲液（150μL）；慢慢的混合样品，室温环境下保持10分钟。再次离心10分钟（4℃，1300RPM），除去上清液。

　　17．加入细胞内抗体包括亚类室温下孵育40分钟，加入透化性缓冲液（150μL），离心样品去除上清液。这个过程可以重复一次。

　　18．加入150μL PBS-W重悬细胞，离心去除上清液，加入200μL 2％的甲醛将细胞移至流式细胞仪管，避光储存于在冰箱中。

　　19．用流式细胞仪分析细胞。激光发光在488nm

　　20．评估结肠固有层细胞单核细胞表型的固有层细胞数量，两种不同的形式表达，一个给定的表型标记的细胞百分比（％），用细胞和亚型对照终止，具有双峰分布和几何平均荧光强度（MFI）。后者方法用单峰分布表型标记的半定量表达。平均荧光强度和频率的基础上，三色流式细胞仪优化用于狗结肠亚型单核细胞表型。分析细胞应侧重于亚群细胞的组成，这些细胞是：CD4，CD4FOXP3，CD8，CD11b，CD11c，TLR9，TLR2，CD14和甘露糖。这为比较狗利什曼病粘膜的各种临床状态提供了一个机会。