一、试验目的

　　了解并掌握垂直板凝胶电泳的使用方法.

　　二、实验原理

　　聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳是以聚丙烯酰胺凝胶做支持物的一种区带电泳,由于此种凝胶具有分子筛的性质,所以本法对样品的分离作用,不仅决定于样品中各组分所带净电荷的多少,也与分子的大小有关.其次,聚丙烯酰胺凝胶电泳还有一种独特的浓缩效应,即在电泳开始阶段,由于不连续pH 梯度的作用,将样品压缩成一条狭窄区带,从而提高了分离效果.

　　聚丙烯酰胺凝胶具有网状立体结构,很少带有离子的侧基,惰性好,电泳时,电渗作用小,几乎无吸附作用,对热稳定,呈透明状,易于观察结果.

　　聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂的作用下,聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物.

　　三、仪器和试剂

　　仪器:电泳仪、垂直平板电泳槽、微量注射器、移液器、灯泡瓶、染色与脱色缸、量筒、滴管.

　　试剂:

　　1. 丙烯酰胺(单体,简称Acr)

　　2. 1%琼脂

　　3. N,N,N,,N,—四甲基乙二胺(TEMED)

　　4. N,N,—亚甲基双丙烯酰胺(交联剂,简称Bis)

　　5. 过硫酸铵(聚合时的催化剂)

　　6. 试剂A(pH8.9):36.6g 三羟甲基氨基甲烷(Tris)和48mL 1mol/l HCl 混合加水至100ml

　　7. 试剂B(pH 6.7):5.98g Tris 和48ml 1mol/lHCl 混合加水至100ml

　　8. 电极缓冲液:6.0gTris 和28.8g 甘氨酸混合加水至1000ml,用时稀释10倍

　　9. 0.05%溴酚蓝

　　10. 20%甘油

　　11. 7%醋酸

　　12. 1mol/l HCl

　　13. 蛋白样品:人或动物血清

　　四、操作步骤

　　1.垂直平板电泳槽的安装

　　先把垂直平板电泳槽和两块玻璃板洗净,晾干.通过硅胶带将两块玻璃板紧贴于电泳槽(玻璃板之间留有空隙),两边用夹子夹住.将1%琼脂糖融化,冷至50℃左右,用吸管吸取热的1%琼脂沿电泳槽的两边条内侧加入电泳槽的底槽中,封住缝隙,冷后琼脂凝固,待用.

　　2.凝胶的制备

　　(1)分离胶的制备

　　称取Acr3.2g,Bis16mg,过硫酸铵16mg 一起置于灯泡瓶中,然后加入试剂A2ml,水14ml,摇匀,使其溶解,然后用真空泵抽气10min,以防止分离胶中的氧气妨碍胶的聚合,随后再加TEMED2滴(滴管内径小于2mm),混匀.用吸管吸取分离胶,沿壁加入垂直平板电泳槽中,直至胶液的高度达电泳槽高度的2/3左右,上面再覆盖一层水或正丁醇(防止氧气扩散进入凝胶抑制聚合),室温下静置约1h 即可聚合.(注意:丙烯酰胺有毒,应避免皮肤直接接触.)

　　(2)浓缩胶的制备

　　称取Acr0.12g,Bis6mg,过硫酸铵16mg,试剂B0.4ml,水2.8ml,摇匀后抽气10min,加TEMED1滴,混匀.用吸管吸取浓缩胶加到分离胶的上面,直至胶的高度为1.5cm,这时将梳板插入,注意梳齿边缘不能带入气泡,室温下静置约0.5～1h 即可聚合.观察梳齿附近凝胶中呈现光线折射的波纹时,浓缩胶即凝聚完成.将梳子拔出后,用电极缓冲液冲洗梳孔.

　　(3)加样

　　用微量注射器分别吸取10mg/l 的标准蛋白样品50μl,上面加20%甘油1滴,溴酚蓝指示剂1滴,再用滴管小心加入少量电极缓冲液使之充满梳孔.

　　(4)电泳

　　将电极缓冲液分别倒入上下电泳槽,接通电源,调节电压为300V,待溴酚蓝移至凝胶底部1～1.5cm时,切断电源.

　　(5)染色

　　将凝胶从玻璃板上取下,放入染色缸中染色20～30min,然后放入7%醋酸中脱色至背景脱尽为止.

　　(6)鉴定

　　根据染色所出现的区带,分析样品的纯度.