【实验目的】

　　学习水平式琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度、构型、含量和分子量大小.

　　【实验原理】

　　闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同,在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率,因而在紫外灯下观察,能区别闭合环状质粒DNA(cccDNA)、线性质粒DNA(L-DNA)和开环质粒DNA(ocDNA).

　　【实验材料和试剂 】

　　(一)实验样品

　　质粒pUC118

　　(二)试剂

　　1．l DNA/HindIII分子量标准

　　2．溴酚蓝指示剂点样缓冲液

　　0.2% 溴酚蓝

　　50% 蔗糖

　　3．1mg/ml溴化乙锭溶液

　　4．电泳缓冲液(TAE)

　　40 mmol/l Tris-乙酸

　　1 mol/l EDTA

　　(配制方法:24.2克Tris碱,5.71ml冰乙酸,10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0),定容至5000ml)

　　5．0.7% 琼脂糖凝胶

　　(配制方法:称取琼脂糖0.35克,加入50ml TAE电泳缓冲液)

　　(三)仪器

　　微量移液器，电泳仪，水平电泳槽，透射紫外观察仪

　　【实验步骤】

　　1．选择合适的水平式电泳槽,调节电泳槽平面至水平.检查稳压电源与正负极的线路.

　　2．选择孔径大小合适的点样梳子,垂直架在电泳胶模的一端,使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm.

　　3．制备0.7%琼脂糖凝胶,100℃水浴加热至琼脂糖融化均匀.

　　4．用吸管取少量琼脂糖凝胶溶液将电泳胶模四周密封好,防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透.待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时,加入一滴溴化乙锭,摇匀,轻轻倒入电泳胶模中,琼脂糖凝胶的厚度在3～5mm.倒胶时要避免产生气泡,若有气泡可用吸管小心吸去.

　　5．琼脂糖凝胶凝固后,在室温放置20分钟,小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端的挡板,保持点样孔的完好.

　　6．将电泳胶模放入电泳槽中,加入电泳缓冲液,使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面1～2mm.如点样孔内有气泡,用吸管小心吸出,以免影响加样.

　　7．将15ml DNA样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合.上样缓冲液不仅可以提高样品的密度,使样品均匀沉到样品孔内,还可以使样品带颜色,便于上样和估计电泳时间和判断电泳的位置.

　　8．用微量移液器将样品小心加入加样孔内,记录样品点样秩序.

　　9．盖上电泳槽,开启电源开关,最高电压不超过5V/cm(100～150V恒压电泳),使DNA从负极向正极移动.

      10．电泳时间随实验的具体要求而异.电泳一般需1～3小时.电泳完毕后关闭电源,戴一次性塑料手套取出凝胶,尽可能将所有的电泳缓冲液淋干,在254nm波长的透射紫外灯下观察.