淋巴细胞主要分T淋巴细胞和B淋巴细胞两大亚群，它们具有不同的特性和功能，为此在进行某些免疫学实验时，首先需分离出纯的T淋巴细胞和B淋巴细胞。本实验介绍了T、B淋巴细胞分离试验的操作步骤。

　　实验原理：

　　淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物(简称AET)处理的绵羊红细胞(SRBC)混合后，其中全部T淋巴细胞均能吸附AET—SRBC，形成牢固稳定而巨大的E—花环，较正常未处理的SRBC形成的E—花环百分比为高，而且形成快速，不易脱落，重复性好。再经淋巴细胞分层液分离时，AET—E花环易沉于管底，而未形成E—花环的T淋巴细胞，用低渗液解花环周围的 AET—SRBC，便可获得纯T淋巴细胞，而B淋巴细胞可直接取自分层液的界面。

　　主要试剂：

　　1. 溴花二氨基异硫氢化物(AET)

　　2. 淋巴细胞分层液

　　3. 其它Hanks液，含小牛血清的199培养液，无菌生理盐水，3.5%氯化钠溶液等。

　　主要设备：

　　离心机，水浴锅，超低温冰箱等。

　　实验材料：

　　1. 新鲜豚鼠血

　　2. 兔红细胞(RRBC)

　　实验步骤：

　　1. AET—RRBC制备

　　1) AET溶液的制备

　　称取AET粉剂402毫克，溶于10毫升蒸馏水中，使成为0.143M溶液，用4N NaOH溶液调pH9.0。该溶液必须新鲜配制，不宜久存。

　　2) AET处理RRBC

　　取洗涤好压积的RRBC，按一份压积AET—RRBC加入4份新鲜配制的pH9.0的AET溶液充分混匀置37℃水浴15分钟，每隔5分钟摇匀一次。取出加冷无菌生理盐水至离心管口(1—2厘米)1800转/分离心5分钟。连续洗涤3—5次，每洗一次，必须充分摇匀，以减少AET—RRBC粘附成团，并观察有无溶血。若有溶血现象，则用含小牛血清的199培养基再洗一次，最后配成10%AET—RRBC悬液，置4℃保存，不得超过5天。

　　3) 1%AET—RRBC的配制：

　　将预先配制并保存于4℃冰箱的10%浓度的AET—RRBC，以含10%小牛血清的199培养液稀释至1%。

　　2. 从新鲜豚鼠血液分离单个核细胞，操作见后试验。

　　3. AET—E花环试验：

　　将分离的单个核细胞(2ⅹ106/毫升)与等量1%AET—RRBC混合，置37℃水浴15分钟，每隔5分钟摇匀一次，分装数管，每管2—3毫升，低速离心(1000转/分钟)5分钟后，移至4℃冰箱45分钟。

　　4. T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离

　　将形成E—花环的细胞悬液，再用淋巴细胞分层液分离，吸取界面云雾状的细胞，即为富含B淋巴细胞群。沉淀于管底的E—花环，用Hanks液洗一次后，加双蒸水3毫升处理3分钟，低渗裂解E—花环周围的RRBC，立即加3.5%氯化钠溶液1毫升，使还原为等渗，低速离心沉淀，即得富含T淋巴细胞群。