实验概要：

　　本方法主要介绍小鼠胚胎干细胞四倍体胚胎嵌合技术流程

　　主要试剂：

　　孕马血清促性腺激素（PMSG），H-CZB，人绒毛膜促性腺激素，电融合液。

　　主要设备：

　　1、超净工作台

　　2、CO2培养箱

　　3、3.5cm培养皿

　　4、15ml离心管

　　持卵针

　　体视显微镜

　　显微操作仪

　　电融合仪

　　实验步骤：

　　①二倍体二细胞胚胎准备：采用8-12周龄的雌性小鼠，第0天约5：00PM注射10 U/只 PMSG；48小时后注射10 U/只HCG，然后将雌鼠与雄鼠合笼；第二天早上检查阴栓，检出有阴栓的雌鼠记为0.5 dpc（days post coit um）；在1.5 dpc处死见栓雌鼠，剪取完整输卵管部分，用装有H-CZB的钝针头插入输卵管的伞口部分，用H-CZB冲输卵管，然后收集受精二细胞胚胎，收集好的二细胞胚胎在CZB培养液中培养，37℃，5% CO2。

　　②电融合：电融合模式设为II型，首先将受精二细胞胚胎用电融合液清洗至少3遍，然后将二细胞依次排列在电融合槽内两个电极之间，每次排列约排列15-20个胚胎，点击开始按钮后，完成电融合过程；将进行电融合操作后的胚胎用HCZB清洗至少三遍以上，放入CZB培养液中培养，（37℃，5% CO2），电融合槽要用蒸馏水至少清理5遍以上；电融合结束后一个小时观察融合结果；将融合的胚胎，继续培养，约培养48小时至54小时后，即可发育成四倍体囊胚，用于四倍体补偿操作。

　　③假孕鼠准备：挑取自然发情雌鼠，与结扎雄鼠合笼交配。在第二天检阴栓，检出阴栓的雌鼠记为0.5 dpc；继续饲养至2.5 dpc，子宫就可以用做受体，进行胚胎移植。

　　④显微操作：用持卵针固定好四倍体囊胚，吸取靠近ICM部分，使ICM部分大约固定在9点位置上；用平口注射针吸取约10-15个供体细胞，从3点位置进针，抵住囊胚透明带及滋养层细胞与细胞间的连接处，用Piezo给电脉冲，使注射针进入囊胚腔，将供体细胞吐出在ICM上。操作完成后的胚胎放在含葡萄糖的CZB培养液中培养。（37℃，5% CO2）。

　　⑤胚胎移植：显微操作完成的胚胎，培养箱中继续培养1-2小时后进行胚胎移植；将2.5 d假孕鼠麻醉后，进行手术，将扩展的囊胚移入子宫角内，每侧子宫移植10-12个胚胎；手术后的小鼠送回鼠房继续培养，17天后，即假孕鼠的第19.5 dpc自然生产或剖腹产。