熟练掌握贴壁细胞传代的培养方法。观察传代细胞贴壁、生长和繁殖过程中细胞形态的变化。

　　实验原理：

　　离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比例转移，接种到另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞的传代则用直接传代法或离心法传代。

　　主要试剂：

　　1. Grace培养基

　　2. 小牛血清

　　3. 0.25％胰蛋白酶

　　4. Hanks液

　　主要设备：

　　1. 生化培养箱

　　2. 倒置显微镜

　　3. 超净工作台

　　4. 高压锅

　　5. 水浴箱

　　6. 离心机

　　7. 血球计数板

　　8. 离心管

　　9. 培养瓶

　　10. 微量加样器

　　11. 吸管

　　12. 移液管

　　13. 酒精灯

　　14. 酒精棉球

　　15. 试管架等

　　实验材料：家蚕

　　实验步骤：

　　1. 在操作前用0.1％新洁尔灭洗净双手，在超净工作台上点燃酒精灯；

　　2. 用75％的酒精棉球擦拭手指及各种盛溶液的瓶子及瓶塞外表面；

　　3. 倒去瓶中的旧培养液，加入0.25%胰蛋白酶1ml；

　　4. 静置消化2～3min，观察培养瓶中细胞开始出现花纹（细胞已经开始脱落），立即竖立培养瓶并倒净胰蛋白酶液；

　　5. 加入3～5ml Grace培养液，用吸管冲洗细胞层，并吹打使其成为细胞悬液；

　　6. 加入10％的小牛血清；

　　7. 分装：一般以1：2进行分装，即一瓶细胞可传为2瓶。分装好的细胞，应在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，置28℃生化培养箱。

　　注意事项：

　　倾倒旧培养液和胰蛋白酶液后，瓶口应在火焰上烧干，勿让余液倒流回瓶中。