荧光定量PCR技术能够实时监测PCR反应,可以准确地测定模板浓度及检测变异基因等, 它克服并改善了传统PCR技术存在的一些问题，如交叉污染、易出现假阳性等。它的准确性高，灵敏度高，重复性好，操作自动化程度高，且简单安全，所以广泛应用于分子生物学及医学等研究领域。本文就PCR原理及其发展应用作一概述。

1 实时荧光定量PCR的原理概述

实时荧光定量PCR是( realtime fluores-cence quantitative PCR，简称qRT-PCR)是在反转录技术的基础上大展起来的，由美国应用生物系统公司发明的一种新型定量实验技术，它可以对基因表达水平进行绝对和相对的准确定量。它是基于化学荧光的PCR检测手段，采用实时分析法的核酸序列定量检测和采用终点和熔解曲线分析法的核酸序列定量检测[1]。并结合7300/7500仪系统软件对产物进行分析，使用比较法（△△CT）来计算核酸序列的相对定量。

qRT-PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团（染料或者探针），利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。一般来说，荧光扩增曲线可以分成荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期三个阶段。在第一阶段，即荧光背景信号阶段，荧光背景信号将扩增的荧光信号掩盖，因此我们无法判断产物量的变化。在第二阶段，即荧光信号指数扩增阶段，扩增产物呈指数级增加。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级增加，PCR的终产物量与起始模版量之间不存在线性关系，因此根据最终的PCR产物量是不能计算出起始DNA拷贝数的。PCR产物量与起始模版量之间存在线性关系只是在荧光信号指数扩增阶段，所以我们通常是在这个阶段进行定量分析的。在指数增长期，我们需要设定一定荧光信号的阈值以便对所检测样本进行比较，这个阈值一般是将PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光阈值设定在PCR扩增的指数期[2]。△Rn（德尔塔校正后报告荧光强度）的一个值是由SDS软件自动确定或手动设置，它用于在实时实验分析中确定CT 值。此阈值应设置为高于基线，但应足够低，将它控制在扩增曲线的指数增长阶段范围之内。用阈值与扩增曲线的交叉点确定CT 值。CT 值即阈值循环，它是荧光信号强度超过设定阈值强度时所经历的循环数即每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。由于每个模板的CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，所以起始拷贝数会越多，CT 值越小。因此我们可以利用已知起始拷贝数的标准品作一个标准曲线，只要获得未知样品的CT 值，就可以从标准曲线上得出该样品的起始拷贝数[3]。

2实时荧光定量PCR的参数指标

基线（Baseline）：是指在PCR扩增反应的最初几次循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线。

荧光阈值（threshold）：一般是将PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光阈值设定在PCR扩增的指数期。

CT 值：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。由于每个模板的CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT 值越小。因此我们利用已知起始拷贝数的标准品作标准曲线，获得未知样品的CT 值，从标准曲线上就可计算出该样品的起始拷贝数[4]。

扩增曲线：PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线。判断扩增曲线是否良好主要有以下几方面：（1）扩增曲线拐点应该清楚，特别是低浓度样本指数期比较明显，扩增曲线整体平行性比较好，基线较平且不能上扬。低浓度样本扩增曲线指数增长期比较明显。（2）扩增曲线指数期斜率应与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高。（3）各PCR管的扩增曲线平行性应较好，表明各反应管的扩增效率相近。（4）标准的基线应平直或者略微下降，无明显的上扬趋势[10]。

熔解曲线：加热PCR产物，随着温度升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会使大量产物解链，荧光强度会急剧下降。我们可以利用该特点及不同PCR产物具有不同的Tm值得特性，可以得知荧光信号迅速下降的温度也不同。PCR产物的特异性由此可以鉴定出。

3实时荧光定量PCR的定量方法

qRT-PCR定量方法分为相对定量法与绝对定量法[5]。根据实验结果要求，我们选择不同的定量方法。在毕业论文中，主要是对坛紫菜光合作用相关酶类进行了克隆，然后对其表达量进行定量分析，在这里我们应用的是相对定量分析法。

绝对定量法一般是用于确定样本中目标核酸序列的绝对量值。采用化学手段合成目的基因，用外标准品实现绝对定量，或者将PCR产物进行克隆并测序确认后获得相应的标准品[6]。绝对定量标准样品的制备：

绝对定量具有结果准确及数据易处理等优点，但其缺点是操作过程比较复杂，标准品制备较难及实验易受环境影响。因此，绝对定量的应用还是有限制的，现在主要用于病原微生物检测和食品质量检测等，相比较于相对定量，它的应用还是比较受限制的。

我们重点介绍一下相对定量分析，它是用来测定一个测试样本中核酸序列与校正样本中同一序列表达的相对变化。而校正样本可以是一个未经处理的对照或者是在一个时程研究中处于零时的样本。例如，相对定量通常用来比较野生型与突变型等位基因的表达水平或不同组织中某个基因的表达水平。相对定量可以对每个样本中模版的其实水平之间的差异进行精确比较，没必要知道模版的确切拷贝数，并且样本模板中的相对水平不用使用标准曲线就可以确定。相对定量分析以实时PCR方式执行，在实时PCR分析过程中，PCR基因扩增一直在监控中，在PCR进行期间进行数据采集，而不是在PCR结束时（终点PCR）才获取数据。在实时PCR中，反应是在目标的扩增最早被监测到时用循环中的时间点来描述的，而不是在PCR结束时通过目标的累计数来描述[7]。

3.1相对定量分析法及实验方案

（1）双标准曲线法

所谓的双标准曲线法就是对内参基因和所研究的目的基因都做绝对定量，然后将各生理阶段的目的基因与内参基因的量相除，得出一个比值，最后再将不同生理阶段所得的比值相除，最终得出目的基因在不同生理阶段的表达变化[8]。

它的优点是思路直观、条理清晰，最大限度的避免了实验的误差，是一种很好的分析方法。

（2）Delta-delta法

该方法是利用管家基因校正样品初始量，在预实验中，必须对目的基因和看家基因做两组标准曲线，如果两者扩增效率相等，就不需要作标准曲线，其计算公式如下：

F=2－[(Cttarget-Ctref)test-(Cttarget-Ctref)calibrator][9]

（3）相对定量实验步骤

确立实验方案—样品制备—设计引物及探针—标准品及标准曲线的建立—定量PCR检测—分析数据

4.实时荧光定量PCR在坛紫菜中的应用

qRT-PCR广泛应用于各项领域，不仅涉及医学、生物学。而且在科研方面也有广泛应用。在本人的毕业论文中，qRT-PCR主要应用在对坛紫菜光合作用相关基因的表达量定量分析方面，首先是将相关基因克隆，测序成功后，设计定量引物，然后再进行定量分析。在这个实验中，主要是对光合作用相关基因在不同世代的表达量进行比较，还有高温胁迫条件下其基因的表达量情况。主要的参数指标是扩增曲线、熔解曲线及CT 值与RQ值，每个水平做三个生物学重复，每个生物学重复需要做四个技术重复，这样我们可以减少误差性，提高实验的精确性，得出数据后，我们采用Excel和SPSS2.0软件对实验数据进行分析，根据得出数据作柱形图，从而能得出相关基因在不同条件下的表达水平。根据一些研究得知，克隆了坛紫菜的磷酸烯醇式丙酮酸[11]，利用实时荧光定量PCR检测出它在生活史不同阶段的差异表达中，发现孢子体中的表达量要高于配子体中的表达量。当紫菜受胁迫的条件下，它的表达量也是随胁迫条件而改变的，说明qRT-PCR可以精确检测不同基因在不同条件或者不同世代、不同生长环境下的表达量，从而可以为我们提供一些指标，为我们改善紫菜的品质和产量提供重要依据。

参考文献：

［1］AryaM, Shergill IS, Williamson M, et al. Basic principles of real-time quantitative PCR [J]. Expert Rev Mol Diagn,2005, 5(2):209.

［2］李光伟,邱杨,肖性龙,等.沙门菌荧光实时定量 PCR 检测试剂的研制及应用[J].生物学通报,2007,34(3):496-499.

［3］胡建华,李洁莉等．牛奶样品中志贺氏菌的快速 PCR 检测技术研究[J].食品科学,2007,8:433-437.

［4］Shindo Y, Kuribara H, Matsuoka T , et al. Validation of real-time PCR analyses for line-specific quantitation of genetically modified maize and soybean using new reference molecules [J].2002, 85(5):1119-1126.

[5]范晓.条斑紫菜壳孢子萌发过程及其世代差异研究.硕士学位论文.中国科学院

研究生院（海洋研究所），2009：66-79.

[6]张成，许阳，王琴等.海藻遗传学.第三版.上海：中国农业科学出版社，2009.

[7]Bagnall DJ, King KW, Farquhar GD. Temperature dependent feedback inhibition

of photosynthesis in peanut. Planta, 1999 (178: 320-334.

[8]Boyle DG, Boyle DB, Olsen V, Morgan JAT, Hyatt AD. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis in amphibian samples using real-time TaqMan PCR assay. Dis Aquat Org, 2008 (90):130-155

[9]PietA , van , Gerard JW , Detection of economically important viruses in boar semen by quantitative Real Time PCR technology Journal of Virological Methods, 2007, 155 :110-128

[10]JanetBarletta1 App lications of real time immuno-polymerase chain reaction ( rt-IPCR) for the rap id diagnoses of viral antigens and pathologic p roteins1 Molecular Aspects of Medicine, 2000, 56:233–264

[11] 王晓荣，李霞.紫菜生活史和繁殖方式的研究现状.中国海洋大学学报,2008 (44) :100-116

美国life荧光定量PCR：http://www.njgc17.com/product_2213_872.html